红树林中的放线菌经自然选择，除了物种多样，甚至还可以抵抗肿瘤

癌症是全世界人类死亡的主要原因之一，目前世界上最常见的癌症是肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌及胃癌等，死亡率最高的癌症包括肺癌、肝癌和乳腺癌(尹周一等，2022)，随着人口老龄化不断加重，中国乃至全球社会受癌症的困扰和压力亦将不断加重。

基于传统化疗出现的各种副作用(Sawadogoetal.，2015)及人类依靠日益强大的科技实力逐渐步入向海洋寻药的药物科研新阶段，大量来自海洋(如海洋藻类(Barbieretal.，2001)，真菌(Duetal.，2010)，细菌(Sagaretal.，2013)，放线菌(Choetal.，2007)，海绵(Zovkoetal.，2016)，软珊瑚(Alcyonacea)(Chaoetal.，2008)等)的代谢物在体外细胞、动物模型和癌症临床试验中表现出了强抗肿瘤作用。

其中放线菌源生物活性化合物作为药物开发先导化合物的重要来源，占总体微生物活性化合物来源的45%以上，而链霉菌属(Streptomyces)来源的活性化合物又占其中的约35%(Xu，2011)，如阿霉素(Tanetal.，1973)、放线菌素D(ActinomycinD)(Young，1969)、阿维菌素(Milleretal.，1979)等均是由链霉菌代谢产物开发为临床药物的成功典范。

海洋放线菌源的化合物盐孢菌素A(sali‐nosporamideA)(Felingetal.，2003)亦已进入治疗胶质母细胞瘤的Ⅲ期临床试验；除此之外，如actino‐furanonesA和B(Choetal.，2006)、aureoverticillac‐tam(Mitchelletal.，2004)、echinosporins(Cuietal.，2007)以及neoantimycinsA和B(Huetal.，2017)等众多具有较高抗肿瘤活性的化合物被陆续发现及研究，凸显出放线菌作为抗肿瘤先导化合物开发的一大热点，越来越受相关领域科研工作者的关注。

红树(Rhizophoraceae)多生长于海陆交界的滨海地带，这些地区兼具海陆两性及高盐、沼泽、缺氧等环境特点，是多种海洋和两栖动物的栖息地。

而红树林中的微生物为应对上述各种极端且复杂的生存条件，经过长期自然选择，逐渐进化出了特殊的生存功能和代谢途径。

近年来，随着红树林放线菌相关研究逐渐成为天然产物资源研究的热点，具有抗菌(向晨晨等，2021)、抗肿瘤(Chenetal.，2017)、抗病毒(李逾，2012)及抗衰老(李蜜等，2020)等作用的红树林放线菌及其生物活性代谢产物也越加频繁地被研究。

全世界红树林面积占比最大的是亚洲(Xuetal.，2014)，中国的红树资源极其丰富，其中广东湛江红树林国家级自然保护区是全国沿海最大的红树林自然保护区(但新球等，2016)，据统计，其中真红树及半红树植物数量分别多达8科13种及8科10种，其中60%为海榄雌(Avicenniamarina)群落(唐秋霞，王友绍，2021)，主要的伴生植物有14科21种，是我国沿海地区红树林种类最丰富的地方。

目前关于湛江红树林放线菌及其化合物生物活性相关研究的数量与规模与日俱增，赵梦冉等(2022)从湛江高桥红树林土壤样品中分离得到的1株具有强抑菌作用的链霉菌次生代谢产物中发现了新化合物germicidinA；许敏等(2016)从湛江高桥、特呈岛两地红树林植物样品内分离出了3株对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)具有较强杀灭活性的放线菌菌株。

本研究对广东湛江雷州沿海地区红树林根际土壤中放线菌的多样性、新颖性及抗肿瘤活性进行研究，初步探索该地区红树林药用放线菌资源及其价值，以期为后续活性物质的开发利用提供菌种储备及信息支持。

2021年3月，从广东湛江红树林国家级自然保护区围绕雷州半岛沿海地区采集红树林不同植物根际下10cm左右的土壤样品，共计8份(S1～S8)，每份样品重复实验3次(n=3)。

样品保存在无菌密封袋中，放置于冰盒中于当天送至实验室，置于4℃冰箱保存待用。

Chelex-100螯合树脂及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液购于北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司；细菌通用引物(27F，1492R)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；所用PCR2×EasyTaqPCRSuperMix及放线菌酮均购自北京全式金生物技术有限公司；CellCountingKit-8试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

多功能细胞成像微孔板检测系统Cytation5和Epoch全波长酶标仪(美国BioTek公司)。

(1)分离培养基：采用10种培养基对全部8个红树林根际土壤样品中的放线菌进行分离，培养基分别为：M1:ISP2培养基、M2:GPT培养基、M3:R2A培养基、M4:ISP5培养基、M5：精氨酸-甘油培养基、M6:ISP7培养基、M7：淀粉-干酪素培养基、M8:1/10ATCC172培养基、M9：察氏培养基、M10：改良高氏一号培养基。

其中M1、M2、M4、M6、M10购自青岛海波生物技术有限公司；M3、M8、M9购自北京陆桥技术股份有限公司；M5购自阿勒山(广州)生物科技有限公司；M7购自上海钰博生物科技有限公司。

(2)纯化培养基：ISP2固体培养基。

(3)发酵培养基：ISP2液体培养基。

选用放线菌酮(50mg/L)、重铬酸钾(50mg/L)和萘啶酮酸(25mg/L)作为杂菌抑制剂，待培养基温度降到50℃左右时分别加入所有10种培养基中并混匀。

人肺癌A549细胞株、人肝癌HepG2细胞株及正常人肺上皮细胞株BEAS-2B皆由广东医科大学生物化学与分子生物学研究所馈赠。

在无菌超净台内，将红树林土壤样品置于无菌玻璃皿中并做好标记，室温条件下自然风干5～7d后，用无菌研钵及研磨棒研磨成粉末状。

分别称取8个样品的土壤粉末10g于90mL无菌PBS中充分溶解，在180r/min，28℃的条件下摇床振荡2h后，超声15min以充分混匀，即为10-1 g/mL的土壤悬液。

取1mL10-1 g/mL的土壤悬液于9mL无菌PBS中，按10倍梯度连续稀释，使样品终浓度为10-2、10-3和10-4 g/mL。

将200μL的3个浓度混悬液分别加入到提前配制的10种不同分离培养基固体平板上，涂布均匀，用合适宽度的保鲜膜包裹平皿边后，置于28℃恒温培养箱培养。

培养2至4周后，观察菌落的形态及生长情况。

挑取单菌落至ISP2固体培养基上，进行三区划线纯化培养，直至得到单一、纯净的菌落。

将纯化、长势良好的的菌株用ISP2固体培养基于28℃中斜面培养3～5d，4℃保存；同时用含无菌20%甘油溶液750μL的冻存管保存于-80℃。

使用Chelex-100法(周双清等，2010)对放线菌菌株基因组DNA进行提取。

使用通用引物对27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16SrRNA的PCR扩增。

PCR反应体系包括：引物(10μmol/L)27F1μL、引物(10μmol/L)1492R1μL、2×Easy‐TaqPCRSuperMix25μL、DNA模板1.5μL、ddH2O21.5μL，总体积为50μL。

PCR扩增参数如下：95℃预变性5min;94℃变性0.5min、55℃退火0.5min、72℃延伸1.5min，循环30次；72℃终延伸10min。

PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段为1500bp左右，1%琼脂糖凝胶电泳验证后，阳性结果PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

所得的16SrRNA序列使用NCBI中的BLAST或EzbioCloud(http://www.ezbioCloud.net)，与获得的序列相似度较高的有效发表的菌株进行16SrRNA序列相似性比对。

采用ClustalW(Thomp‐sonetal.，1994)进行序列比对和系统发育分析，采用邻接(neighbor-joining，NJ)法(Saitou，Nei，1987)在MEGA-X(Kumaretal.，2018)软件上进行聚类分析，并构建系统进化树。

利用Kimura'stwo-parame‐ter(Kimura，1980)模型和基于1000次重复的boot‐strap自展值分别评估进化矩阵和进化树拓扑结构的稳定性。

先挑取每个待发酵放线菌各2～3个长势良好的菌落，分别均匀分散至提前准备的含5mL无菌ISP2液体培养基的离心管中，再从各个离心管中分别吸取菌悬液按1∶50的比例加入装有100mLISP2液体培养基的500mL锥形瓶中，每株菌接种3瓶，在28℃、180r/min条件下摇床发酵7d。

收集发酵液至500mL无菌离心管中，8500r/min离心15min后，上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，收集上层酯层并旋转蒸发至干燥，干燥的发酵粗提物加入1.5mL无水甲醇溶解，过0.22μm除菌滤膜后得到放线菌株发酵粗提物甲醇溶液，保存于-20℃备用。

测定发酵粗提物对人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2的体外抗肿瘤活性和对正常人肺细胞株BEAS-2B的体外细胞毒性。

上述3个细胞株用含有1%青链霉素混合液(双抗)及10%胎牛血清的DMEM(以下简称完全培养基)进行培育，在37℃，含体积分数为5%CO2环境下培养，约2d传代1次。

用PBS清洗处于对数生长期的2种肿瘤细胞及1种正常细胞，并用0.25%胰蛋白酶消化，消化结束后加入完全培养基终止消化，最后1000r/min离心3min以收集细胞进行96孔板种板。

将细胞密度调整为5×104个细胞/mL，然后将细胞悬液加入96孔板中，每孔100μL(约5000个细胞)，同样置于37℃，含5%体积分数CO2的无菌培养箱中培养。

用完全培养基将发酵粗提物样品稀释至1mg/mL，再梯度稀释至500、200、100和10μg/mL。

当细胞贴壁完成后，吸去培养液，每孔重新加入含不同浓度提取物的完全培养基100μL。

阳性对照为顺铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)，将2种阳性对照药物溶解于含5%甲醇的完全培养基中，稀释至10μg/mL；阴性对照为未处理的含5%甲醇的完全培养基。

培养48h后，通过CellCountingKit-8(CCK-8)试剂测定细胞活力值，在黑暗条件下，每孔加入CCK-8试剂10μL，继续37℃培养2h，后用酶标仪测定450nm处每孔的吸光度。

通过计算细胞活力值来表征初筛下不同浓度发酵液对细胞的抑制作用，每组设3个复孔(n=3)，取平均值。

根据初筛所得各发酵粗提物样品的细胞活力值，选择在300μg/mL浓度下即对A549细胞及HepG2细胞具有显著抗肿瘤活性的样品进行抗肿瘤有效浓度复筛，接种浓度范围根据每个样品的初筛结果选取。

其次选择在500μg/mL下即对A549细胞具有显著抗肿瘤活性的样品进行对BEAS-2B细胞的细胞毒性试验。

上述3种细胞的培养条件、处理方法、接种方法及接种浓度等同上面的方法。